运输和保存：干冰运输及复苏好存活细胞：（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理：

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。  

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备MEM（含NEAA）培养基；优质胎牛血清，10%；p/s双抗，1%。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：50%基础培养基，40%FBS，10%DMSO，现用现配

二． 细胞处理：

1.  吸出原培养液；

2.  加入2ml左右PBS，轻轻晃动培养瓶润洗细胞,吸出PBS丢弃；

3. 加入1ml左右0.25%胰蛋白酶溶液（含EDTA），轻轻晃动培养瓶 使之浸润所有细胞；

4.放入培养箱消化，显微镜下看到细胞块中间的细胞明显变圆有间 隙时可终止，全程不要拍打培养瓶；

5.加入3ml含血清的培养基终止消化，吹打细胞使之脱壁并在液体 里反复吹打使细胞尽量呈单颗细胞的悬浮液；

6.收集细胞悬液离心，1200rpm/min 3分钟，离心完吸出上清丢弃 ；

7.加入新鲜培养基，吹打几下混匀细胞即可，按比例接种到新培养 瓶，补足培养基，拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养。

3） 细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。