运输和保存：干冰运输及复苏好存活细胞：（1）1mL 冻存管包装干冰运输，收 到后-80 度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存 管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。（2）T25 瓶复苏的存活 细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理：

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）半贴细胞和贴壁不牢（悬浮）细胞：T25瓶置于37℃培养箱中约2-3h，显微镜下观察细胞的情况，若细胞密度在60%以下，客户需收集T25瓶中的悬浮细胞离心后用完全培养基重悬后打回到原培养瓶中继续培养，若细胞生长70%-90%对细胞进行传代，传代时需要收集培养基中悬浮的细胞离心后回收。

4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

 1）准备RPMI-1640培养基；   87%

优质胎牛血清；   10%

Sodium Pyruvate丙酮酸钠   1%

GlutaMAX-1谷氨酰胺   1%

P/S青霉素-链霉素   1%

2）培养注意事项：

a.该细胞并不形成一致的单层，而是形成集落，成岛式生长；

b.该细胞会使培养基快速变酸，且生长缓慢，故传代后 48 小时内不应扰动；

c.普通TC处理的培养瓶或皿不能使细胞很好的贴壁，培养难度较高，需使用 Corning 的 cellbind 细胞培养瓶，或者使用多聚-L-赖氨酸溶液包被过的培养皿；

d.在细胞运输途中，多数细胞会从培养瓶底分离，大片悬浮在培养基中，按照收货注意事项处理即可恢复正常。

收货后，如果发现细胞漂浮或成团，可按下面的步骤进行处理：

01 将培养瓶内的所有培养基，转入无菌离心管，离心收集细胞（1200rpm 5min）；

02 去掉上清，用PBS重悬细胞，将细胞收集到一个离心管中，PBS震动离心管混匀即可，再次离心（1200rpm 5min）；

03 去掉上清，加入1ml左右0.25%胰酶，重悬混匀细胞。震动离心管，混匀即可，不能吹打。放入培养箱，消化细胞，消化时间3分钟左右；

04 消化完毕后，用移液枪轻轻吹打细胞悬液，使细胞团分散。加入5ml含血清的培养基，混匀后终止消化，离心（1200rpm 5min）；

05 去掉上清，加入5-7ml相应完全培养基混匀，轻轻/反复吹打细胞，接种于无菌T25瓶中（接种容器应提前用对应培养基浸润）。

3）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

4）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1） 冻存细胞的复苏：

将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含 4-6mL 完  全培养基的离心管中混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 3-5min ，弃去上清液， 完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含 6-8mL 完全培养基的培养瓶（或皿） 中 37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

该细胞为悬浮和轻微的贴壁细胞，传代可以参考以下方法：

①1.收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

2.加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3. 将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

三，细胞冻存：收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

注意事项：

1.  所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作， 并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

2.  建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意：冻 存管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能导 致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。