运输和保存：干冰运输及复苏好存活细胞：  (1) 1mL 冻存管包装干冰运输，收 到后-80 度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存 管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。  (2) T25 瓶复苏的存活 细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理：

1) 收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将 T25 瓶置于 37℃培养箱放置约 2-3h ，若发 现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2) 请在 4 或 5X 显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照 (10× ，20    ×)各 2-3 张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3) 半贴细胞或贴壁不牢 (悬浮) 细胞：T25 瓶置于 37℃培养箱中约 2-3h ，显微 镜下观察细胞的情况，若细胞密度在 60%以下，客户需收集 T25 瓶中的悬浮细胞 离心后用完全培养基重悬后打回到原培养瓶中继续培养，若细胞生长 70%-90%   对细胞进行传代，传代时需要收集培养基中悬浮的细胞离心后回收。

4) 备注：运输用的培养基 (灌液培养基) 不能再用来培养细胞，请换用按照说 明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建 议 T25 培养瓶 1 ：2 传代 。

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1) 准备 RPMI- 1640 培养基；优质胎牛血清，20%；0.01mg/ml胰岛素；双抗，1%。

2) 注意事项：

(a) 在细胞生长的初始阶段，细胞以贴壁的形式生长并呈现出长方体的形态 和有“伪足”延伸。随着培养时间的增加，细胞呈现圆形并以叠加的形式生 长。细胞密度达到一定的程度，会有细胞以悬浮的方式散落到到培养基中， 镜下观察会发现悬浮和贴壁的细胞会同时出现。 (b) 该细胞传代时不需要用 胰酶消化。传代时，用无菌细胞刮刮拭培养表面将细胞刮落，收集离心后重 悬接种到新的培养瓶中。 (c) 该细胞形态上包含松散贴壁的纺锤形和圆形或 者立方形。当细胞密度较大时，细胞会轻微脱落变圆或者许多细胞堆积在一 起，有些细胞甚至脱落漂浮。这些漂浮的细胞是存活的，在传代时应收集起 来，离心后细胞沉淀可以继续培养。  (d) 血清质量差异可能引起细胞贴壁能

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力变化，应选用高质量的胎牛血清。

3) 培养条件：  气相：空气，95%；二氧化碳，5% 。  温度：37 摄氏度，培养箱 湿度为 70%-80%。

4) 冻存液：10%血清，10%DMSO ，80%完全培养基。

二． 细胞处理：

1) 冻存细胞的复苏：

将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含 4-6mL 完 全培养基的离心管中混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 3-5min ，弃去上清液， 完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含 6-8ml 完全培养基的培养瓶(或皿) 中 37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2)  细胞传代：如果细胞密度达 70%-90% ，即可进行传代培养。

该细胞为悬浮和轻微的贴壁细胞，传代可以参考以下方法：

该细胞用细胞刮铲替代胰酶来对细胞进行处理。用无菌细胞刮铲刮拭细胞 附着培养表面将细胞刮落，收集细胞后离心去上清，重悬后接种到新的装有新鲜 培养液的培养瓶内。收货后第一次传代 1 :2 进行，后续可以根据实际的情况以 1 :2~1:4 的比例进行传代。

3) 细胞冻存:  收到细胞后建议在培养前 3 代时冻存一批细胞种子以备后续实验 使用。下面 T25 瓶为例；

1.  1，细胞用细胞刮铲替代胰酶来对细胞进行处理。用无菌细胞刮铲刮拭细胞 附着培养表面将细胞刮落，收集细胞。

2.  1000rpm 离心 3-5min ，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每 1ml 冻存液含 1×106~1×107 个活细胞/ml 分配到一个冻存管中将细胞分配到 冻存管中，标注好名称、代数、 日期等信息。

3.  将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80 度冰箱中过夜，之后转入液氮容器 中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。