运输和保存：干冰运输及复苏好存活细胞：  (1) 1mL 冻存管包装干冰运输，收 到后-80 度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存 管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。  (2) T25 瓶复苏的存活 细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理：

1) 收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将 T25 瓶置于 37℃培养箱放置约 2-3h ，若发 现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2) 请在 4 或 5X 显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照 (10× ，20    ×)各 2-3 张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3) 贴壁细胞：细胞在 37℃培养箱中放置 2-3h ，显微镜下观察细胞的生长和贴壁 情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜 下观察细胞的生长密度若在 60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基 (若有未贴壁 的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中),加入新配制的完全培养基 6-8mL， 放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达 70%-80%以上，可以对细胞进行 传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4) 备注：运输用的培养基 (灌液培养基) 不能再用来培养细胞，请换用按照说 明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建 议 T25 培养瓶 1 ：2 传代 。

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1) 准备 MEM 培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2) 培养条件：  气相：空气，95%；二氧化碳，5% 。  温度：37 摄氏度，培养箱 湿度为 70%-80%。

3) 冻存液：90%血清，10%DMSO ，现用现配。

二． 细胞处理：

1) 冻存细胞的复苏：

将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含 4-6mL 完 全培养基的离心管中混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 3-5min ，弃去上清液，

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完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含 6-8ml 完全培养基的培养瓶(或皿) 中 37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2)  细胞传代：如果细胞密度达 80%-90% ，即可进行传代培养。 对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.  弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

2.  加入 0.25％ (w / v) 胰蛋白酶-0.53 mM EDTA 于培养瓶中 (T25 瓶 1-2mL，

T75 瓶 2-3mL) ，置于 37℃培养箱中消化 1-2 分钟 (难消化的细胞可以适当延长 消化时间) ，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅

速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入 3-4ml含 10%FBS 的培养基来终止消化。 3.轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 3-5min ，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。将细胞悬液按 1 ：2 的比例分到新 T25 瓶中，添加 6-8ml 按照 说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际 情况按 1 :2~1:5 的比例进行。

3) 细胞冻存:  收到细胞后建议在培养前 3 代时冻存一批细胞种子以备后续实验使 用。下面 T25 瓶为例；

1.  细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血 球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为 1×106~1 ×107 个活细胞/ml.

2. 1000rpm 离心 3-5min ，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每 1ml 冻存液含 1×106~1×107 个活细胞/ml 分配到一个冻存管中将细胞分配到 冻存管中，标注好名称、代数、 日期等信息。

3.  将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80 度冰箱中过夜，之后转入液氮容器 中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。