运输和保存：干冰运输及复苏好存活细胞：（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理：

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）半贴细胞或贴壁不牢（悬浮）细胞：T25瓶置于37℃培养箱中约2-3h，显微镜下观察细胞的情况，若细胞密度在60%以下，客户需收集T25瓶中的悬浮细胞离心后用完全培养基重悬后打回到原培养瓶中继续培养，若细胞生长70%-90%对细胞进行传代，传代时需要收集培养基中悬浮的细胞离心后回收。

4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代。

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备培养基1640，10%FBS，0.05mM β-巯基乙醇。

2） 培养条件：空气95%，二氧化碳5%；温度37℃

冻存液：90%FBS，10%DMSO，现用现配。

二． 细胞处理：

1） 冻存细胞的复苏：：

1.1准备一个T25的细胞培养瓶并做好标记，预热好的细胞完全培养基，一支15ml

离心管，离心管中加入4-5ml细胞完全培养基。

1.2取出细胞冻存管，在37度水浴中快速解冻，将管子擦干消毒后迅速拿回生物安全柜。

1.3将细胞悬液转移到加有培养基的离心管中，1000转离心5分钟。

1.4倒掉上清，加入培养基轻轻重悬细胞亦可先将细胞团弹散后加入培养基混匀。

1.5将重悬好的细胞转移到T25细胞培养瓶，补充培养基到5ml左右，十字摇晃，将细胞铺匀后放入培养箱培养。

细胞传代：

第一种方法：

2.1细胞密度达到1×106细胞/ml时，1000转离心5分钟收集细胞，弃上清，加入新鲜培养基，使细胞密度在3-4×105细胞/ml.

第二种方法：

2.2细胞密度达到1×106细胞/ml时，将培养瓶中的细胞悬液分装到新的培养瓶，并补充新鲜培养基，使细胞密度在3-4×105细胞/ml.3）

三，细胞冻存:

将培养瓶中的细胞悬液转移到离心管中，1000转离心5分钟收集细胞，弃上清，加入冻存液，重悬细胞，并分装到冻存管，冻存密度2-3×106细胞/ml。将冻存管放入程序降温盒，并放到-80℃冰箱，过夜后将冻存管转移到液氮保存。

注意事项：

 1. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

2. 建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意：冻存管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能导致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。