运输和保存：干冰运输及复苏好存活细胞：（1）1mL 冻存管包装干冰运输，收 到后-80 度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存 管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。（2）T25 瓶复苏的存活 细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理： 1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将 T25 瓶置于 37℃培养箱放置约 2-3h，若发 现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。 2）请在 4 或 5X 显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20 ×）各 2-3 张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。 3）半贴细胞或贴壁不牢（悬浮）细胞：T25 瓶置于 37℃培养箱中约 2-3h，显微 镜下观察细胞的情况，若细胞密度在 60%以下，客户需收集 T25 瓶中的悬浮细胞 离心后用完全培养基重悬后打回到原培养瓶中继续培养，若细胞生长 70%-90% 对细胞进行传代，传代时需要收集培养基中悬浮的细胞离心后回收。 4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说 明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议 T25 培养瓶 1：2 传代。

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备： （1）培养条件：DMEM＋10% FBS＋1% P/S；空气 95%，二氧化碳 5%；37℃培养。 （2）冻存液：55%基础培养基+40%FBS+5%DMSO。 

二．细胞处理： 

1） 冻存细胞的复苏： 将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含 4-6mL 完 全培养基的离心管中混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 3-5min，弃去上清液， 完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含 6-8mL 完全培养基的培养瓶（或皿）中 37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。 

细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。 对于贴壁细胞传代可以参考以下方法： 1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。 2.加入 0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mM EDTA 于培养瓶中（T25 瓶 1-2mL，T75 瓶 2-3mL），置于 37℃培养箱中消化 1-2 分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时 间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回 操作台，轻敲几下培养瓶后加入 3-4mL 含 10%FBS 的培养基来终止消化。 3.轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 3-5min，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。将细胞悬液按 1：2 的比例分到新 T25 瓶中，添加 6-8mL 按照说 明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况 按 1:2~1:5 的比例进行。

三，细胞冻存: 待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入 少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约 1ml 含血清的培养基后加入冻存管中，再添 加 10%DMSO 后进行冻存。 

注意事项： 1. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作， 并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。 2. 建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意：冻 存管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能导 致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。