细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备培养基；DMEM/F12 基础培养基      88%

        优质胎牛血清               10%

        ITS(胰岛素+转铁蛋       1%

        Dexamethasone  地塞米松   40ng/ml

            P/S青霉素-链霉素        1%

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5% 。 温度：37 摄氏度，培养箱 湿度为 70%-80%。

3）冻存液：FBS 90%，DMSO 10% ，现用现配

二．细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含 4-6mL 完全培养基的离心管中混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 3-5min ，弃去上清液， 完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含 6-8ml 完全培养基的培养瓶（或皿） 中 37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达 80%-90% ，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.  弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

2.  加入 0.25％（w / v ）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA 于培养瓶中（T25 瓶 1-2mL ，T75 瓶 2-3mL） ，置于 37℃培养箱中消化 1-2 分钟（难消化的细胞可以适当延长消化 时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿 回操作台，轻敲几下培养瓶后加入 3-4ml 含 10%FBS 的培养基来终止消化。

3.  轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 3-5min，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。将细胞悬液按 1：2 的比例分到新 T25 瓶中，添加 6-8ml 按照说 明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况 按 1:2~1 :4 的比例进行。

3） 细胞冻存:  收到细胞后建议在培养前 3 代时冻存一批细胞种子以备后续实 验使用。下面 T25 瓶为例；

1.  细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血 球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为 1×106~1 ×107 个活细胞/ml.

2.  1000rpm 离心 3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每 1ml 冻存液含 1×106~1×107 个活细胞/ml 分配到一个冻存管中将细胞分配到 冻存管中，标注好名称、代数、 日期等信息。

3.  将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80 度冰箱中过夜，之后转入液氮容器 中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

注意事项：

1.  所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作， 并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

2.  建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意： 冻存管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能 导致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。